Como a maioria das tartarugas, tartarugas de orelha vermelha não têm diferenças óbvias de gênero ao nascer. Na maturidade sexual, porém, diferenças são mais pronunciadas. Macho geralmente maduro aos 2-5 anos, ou carapaça de 10 cm. Fêmea madura após 5-7 anos ou carapaça de 15-18 cm. Uma vez adulta, use métodos seguros para determinar sexo.
Segure a tartaruga de cabeça para baixo cuidadosamente para cauda totalmente visível.
Encontre a cloaca, abertura posterior na cauda. Usada para excretar fezes/urina e fêmea botar ovos.
Examine cauda e cloaca. No macho, cloaca fica mais abaixo na cauda que na fêmea, e cauda do macho tipicamente mais longa e grossa. Quando cauda totalmente estendida, cloaca do macho passa borda da carapaça. Na fêmea, cloaca mais próxima do corpo, cauda tipicamente menor.
Segure tartaruga para garras dianteiras totalmente visíveis.
Examine garras dianteiras. Garras do macho muito mais longas que da fêmea. Garras longas auxiliam no cortejo e acasalamento.
Segure tartaruga para plastrão (lado inferior da carapaça) visível. Examine "barriga", veja se plastrão é côncavo ou curva para dentro, outro sinal de macho.